Saimnieks LV / 2021.gads (Decembris.)

Mūsdienās ģenētisko modifikāciju metodes ir daudz precīzākas nekā pirms 25 gadiem, kad tika reģistrētas pirmās ģenētiski modificēto augu līnijas rapsim, sojai, kukurūzai un citiem kultūraugiem.1 Šīs metodes ļauj ievērojami paātrināt selekcijas procesu. Šajā rakstā nedaudz par to, kas pašlaik nodarbina augu ģenētiķus pasaulē.

Mieži. Zinātnieku grupas CREA Research Centre for Genomics and Bioinformatics Itālijā prioritāte ir paaugstināt auglību un graudu veidošanos miežiem. Šajā darbā ir jāņem vērā, ka ogļhidrātu jeb cukuru pārvietošanās īpatnības augā no to avota uz uzglabāšanas audiem ietekmē daudzus augu augšanas aspektus. Ogļhidrāti augos rodas fotosintēzes procesā. Galvenā ogļhidrātu transporta forma ir disaharīds saharoze, bet daži augi var transportēt lielākas cukuru molekulas, kā arī cukuru spirtus. Galvenā ogļhidrātu uzglabāšanas forma augos ir ciete.7 Itāļu zinātnieku grupa, pētot SWEET gēnus miežos, konstatējusi, ka HvSW4 gēna aktivitāte ir saistīta ar vīrišķo sterilitāti. Savukārt SW4 ietekmē sēklu aizmešanās efektivitāti vārpā un vārpu skaitu. Graudu ražu miežiem raksturo graudu skaits uz laukuma vienību, graudu svars, vārpu skaits uz auga, graudu skaits vārpā, graudu lielums un graudu piepildījums. Pētījumos konstatēts, ka graudu īpašības ietekmē vairāki miRNS gēni, bet gēni GRF4, SW5 un miR397/LAC ietekmē graudu garumu, platumu un biezumu.²

Savukārt britu zinātnieki no Sainsbury Laboratory ir radījuši kailgraudu miežus GE-NUD Barley, kuriem ar CRISPR-Cas9 gēnu rediģēšanas metodi ir daļēji dzēsta nud gēna, kas kodē etilēna atbildes transkripcijas faktoru, kodējošā sekvence. Šis gēns atbild arī par plēkšņgraudu miežu fenotipu un plēksnes piesaistīšanos pie grauda.¹² 2020. gadā šo miežu izstrādātājs pieteica lauka izmēģinājumus ASV, lai noteiktu kailgraudu fenotipa ietekmi uz agronomiskajām īpašībām, iesala un alus ražošanas kvalitāti. Tiek prognozēta par 10 % mazāka raža, iesala ekstrakta pieaugums 7 % bez citām fenotipiskām izmaiņām.¹⁴ Tiesa, tirgū jau ir pieejamas tradicionālās selekcijas ceļā iegūtās kailgraudu miežu šķirnes, kā arī ir zināms, ka kailgraudu mieži eksistēja jau pirms mūsu ēras⁸. Kailgraudu miežu selekcija no tiek arī Latvijā, kur ir reģistrētas šķirnes ‘Irbe’ un ‘Kornelija’ (AREI). Šiem kailgraudu miežiem nud gēnā ir dabiska mutācija.

Tomāti. Zinātnieki no Japānas Tsukuba Universitātes sadarbībā ar kompāniju Sanatech Seed Co. ir izveidojuši genomiski rediģētus tomātus high GABA Tomato, kuru augļi satur paaugstinātu γ-aminosviestskābes (γ-aminobutyric acid, GABA) koncentrāciju. Japāņu zinātnieki jau pagājušā gadsimta 90. gados bija konstatējuši, ka tomātu augļi dabiski satur salīdzinoši daudz šīs vielas¹¹.

Šie tomāti iegūti, izmantojot Solanum lycopersicum šķirni ‘Sicilian Rouge CF’, ar CRISPR/Cas tehnoloģiju veicot izmaiņas glutamīnskābes dekarboksilāzes gēnā (gad). Mutācijas mērķis bija paaugstināt GABA veidošanos tomātu augļos. GABA ir neproteinogēna aminoskābe, līdz ar to tai ir pozitīva ietekme uz cilvēku veselību, piemēram, pazemina paaugstinātu asinsspiedienu. GABA ietekme ir neitrāla cilvēkiem ar normālu asinsspiedienu. Glutamāta dekarboksilāze ir galvenais enzīms GABA biosintēzē. Šim enzīmam ir kalmodulīna saistošais domēns, kas regulē enzimātisko funkciju. Šī domēna zudums paaugstina GAD aktivitāti. Tomāta genoms satur piecus gad gēnus, no kuriem trīs izpaužas augļu attīstības laikā. GABA Tomato izstrādātājs izmainīja vienu no šiem gēniem. Jaunā tomātu šķirne tika iegūta, izmantojot Agrobacterium tumefaciens mediētu transformāciju ar T-DNS, kas saturēja Cas9 sekvenci un DNS sekvences mērķa gēnam specifiskām guide RNS. Tā rezultātā iegūtā viena bāzu pāra ievietošana izraisīja stop-kodona izveidošanos pirms pašinhibējošā kalmodulīna domēna. Jaunā tomātu līnija gatavos augļos uzkrāj četras līdz sešas reizes vairāk GABA nekā citas tomātu šķirnes. Iegūtā īpašība ir stabila vismaz trīs paaudzēs.¹¹ Pašlaik šie tomāti ir izplatīti Japānā individuāliem audzētājiem13, kā arī 2020. gadā ir iesniegts pieteikums USDA¹⁵. Bija plānots uzsākt augļu pārdošanu tirdzniecībā Japānā no 2021. gada 15. septembra.

Tomāti ar augstu γ-aminosviestskābes saturu.  
(Avots: https://sanatech-seed.com/en/airprocess200817/)

Soja. Sojas eļļa dabiski satur salīdzinoši daudz polinepiesātināto taukskābju, kas veicina eļļas bojāšanos oksidācijas procesā. Lai samazinātu polinepiesātināto taukskābju daudzumu, ir iespējams pielietot sojas eļļas hidrogenāciju, taču tās rezultātā papildus veidojas cilvēka veselībai kaitīgas trans-taukskābes. Tādējādi viens no sojas selekcijas mērķiem ir šķirnes ar palielinātu mononepiesātināto un samazinātu polinepiesātināto taukskābju sastāvu (Clemente and Cahoon, 2009). ASV kompānija Calyxt ir izveidojusi sojas šķirni ‘FAD2KO’ jeb soju ar augstu oleīnskābes saturu. Šai sojai ir delēcijas divos gēnos FAD2-1A un FAD2-1B. Tās deaktivizē šos gēnus, kas kodē taukskābju desaturāzes enzīmus. FAD2 taukskābju desaturāzes nosaka mononepiesātināto taukskābju daudzumu sojas eļļā, un šo divu gēnu izslēgšana noved pie oleīnskābes (mononepiesātinātas omega-9 taukskābes) daudzuma pieauguma līdz aptuveni 80 %. Sojas sēklām briestot, oleīnskābe tiek pārvērsta par linolskābi piesātinājuma samazināšanas procesā, kuru veic FAD2 gēna kodētā Δ12 taukskābju desaturāze. Linolskābe tālākā desaturācijas procesā, kuru veic FAD3 gēna kodētā Δ15 taukskābju desaturāze, tiek pārvērsta par linolēnskābi.³ ‘FAD2KO’ sojas līnija tika izveidota Agrobacterium rhizogenes K599 saknīšu transformācijas ceļā, izmantojot sojas šķirnes ‘Bert’ dīgļus. Genoma rediģēšana tika panākta ar TALEN enzīmus izceļošo T-DNS konstrukciju. ‘FAD2KO’ soja nav autorizēta ES. 2019. gadā ir uzsākta ‘FAD2KO’ sojas eļļas izplatīšana ASV tirgū ar preču zīmi Calyno™ High Oleic Soybean Oil. ASV USDA APHIS ir atzinis, ka ‘FAD2KO’ soja nav pakļauta regulācijas prasībām, jo tā nesatur DNS no citiem organismiem, kas varētu būt augu vai dzīvnieku kaitēkļi. Tomēr šīs sojas audzēšana, pārstrāde un tirdzniecība notiek nodalīti no parastās sojas audzēšanas, pārstrādes un tirdzniecības procesa, kā arī tiek nodrošināta augsta izsekojamība (Identity-Preserved Supply Chain).¹⁰ No šīs sojas ir iegūta nākamā sojas šķirne, kas tiek izplatīta ar preču zīmi High oleic low linolenic (HOLL). Nesen Calyxt paziņoja, ka attīstīs jaunu sojas produktu, kas spēs aizstāt videi mazāk draudzīgo palmu eļļu.

Kukurūza. Kompānija Pioneer Hi-Bred International, Inc. ir iesniegusi ES kukurūzas DP915635 autorizācijas pieteikumu. Šī kukurūza paredzēta izmantošanai pārtikā un barībā, bet ne audzēšanai. DP915635 ir ievietota integrācijas vietu secība, kas tiek dēvēta par nosēšanās paliktni (landing pad). Proti, noteiktā kukurūzas genoma vietā ar mikroprojektīvu bombardēšanu un CRISPR-Cas9 starpniecību ar rekombinācijas metodi, izmantojot Agrobacterium mediēto transformāciju, mērķtiecīgi kukurūzas genoma nosēšanās paliktnī ievieto paredzētās ekspresijas kasetes. Kukurūza DP915635 ir ģenētiski modificēta, lai tā izceltu IPD079Ea proteīnu, kas iegūts no epifītiskas papardes Ophioglossum pendulum. Šis proteīns rada izturību pret kukurūzas sakņu kaitēkļiem. Vēl šī kukurūza izceļ fosfinotricīna acetiltransferāzes proteīnu (PAT), kas ir iegūts no baktērijas Streptomyces viridochromogenes un piešķir toleranci pret gufozinātu saturošiem herbicīdiem, kā arī fosfomannozes izomerāzes proteīnu (PMI) no Escherichia coli, kas ir izmantots kā selekcijas marķieris izstrādes procesā. Pieteikuma iesniedzējs pauž, ka nav pieejamas ziņas par to, ka no epifītiskajām sūnām iegūtais proteīns varētu būt toksisks cilvēkiem vai lauksaimniecības dzīvniekiem, kā arī nav liecību par to, ka šāds proteīns varētu radīt apdraudējumu videi. Zīdītāju gremošanas traktā notiek ātra šī proteīna sašķelšana. Savukārt PAT un PMI proteīni jau ir iepriekš izmantoti citiem ģenētiski modificētiem kultūraugiem, un tiem jau ir droša izmantošanas vēsture. Visi minētie proteīni kukurūzas audos ir zemās koncentrācijās, kas garantē patērētāju drošību.⁵

Līdzīgā veidā ir radīta kukurūza DP23211, kuras izstrādātājs arī ir kompānija Pioneer Hi-Bred International, Inc. Arī šo kukurūzu ir paredzēts ES izmantot pārtikai un dzīvnieku barībai, bet ne audzēšanai, un tās izveidē tāpat ir izmantota integrācija konkrētā genoma vietā. Tiek izmantota I-CreI endonukleāze, kas pieder pie meganukleāzēm. Vispirms kukurūzas genomā ar biolītisko bombardēšanu tika ievietots DNS fragments jeb tā saucamais nosēšanās paliktnis. Pēc tam ar Agrobacterium transformācijas palīdzību šūnā ievadīja T-DNS, kas integrējās specifiskajā integrācijas vietā, kas atrodas šajā nosēšanās paliktnī. Šī kukurūza izceļ DvSSJ1 divpavediena RNS un IPD072a proteīnu, kas abi nodrošina izturību pret kukurūzas sakņu kaitēkļiem, kā arī jau iepriekš minētos PAT un PMI proteīnus. Proteīns IPD072a ir iegūts no baktērijas Pseudomonas chlororaphis. PAT proteīnu kodējošais mo-pat gēns ir iegūts no Streptomyces viridochromogenes⁶. Divpavediena RNS drošumu jau agrāk ir izvērtējusi Eiropas Pārtikas nekaitīguma iestāde.⁴

Kartupeļi. Zviedru kompānija SolEdits ir izveidojusi kartupeļus, kuriem ir izmainīta amilozes/amilopektīna attiecība cietē. Kartupeļu bumbuļi ir nozīmīgs cietes avots cilvēku uzturā. Ciete sastāv no glikozes vienībām, kuras gareniski saista α (1 → 4) glikozīdsaites, bet sazarojumus veido α (1 → 6) saites. Ciete bumbuļos tiek uzkrāta noteiktā veidā strukturētu cietes granulu formā, ko nodrošina stipri sazarotas amilopektīna molekulas un nesazarotas lineāras amilozes molekulas attiecībā apmēram 4:1. Pārtikas produktos augsts amilozes saturs un garas amilopektīna ķēdes nodrošina to, ka veidojas rezistenta ciete, kas ir saistīta ar zemu glikēmisko indeksu pēc uzņemšanas uzturā [17]. Glikēmiskais indekss tiek aprēķināts, mērot cukura pieaugumu asinīs pēc noteikta glikozes daudzuma apēšanas trīs stundu laikā salīdzinājumā ar glikozes pieaugumu asinīs pēc kāda pārtikas produkta uzņemšanas, kas satur tikpat daudz ogļhidrātu. Glikozes glikēmiskais indekss un ogļhidrātu saturs ir 100 %. Kartupeļu glikēmiskais indekss ir 62–85 %, bet ogļhidrātu saturs kartupeļos ir 15–18 %. Glikēmiskais indekss ir atkarīgs no cietes formas (amiloze vai amilopektīns) produktā, cietes daļiņu lieluma un produkta termiskās apstrādes.16 Vēl cits zviedru zinātnieku selekcionēto kartupeļu pielietojums nākotnē varētu būt saistīts ar bioplastmasas ieguvi. Pētījumi par to, kā iegūt kartupeļus ar uzlabotu cietes kvalitāti, notiek jau ilgu laiku. Kartupeļi, kas sintezē tikai amilopektīnu saturošu cieti, ir iegūti ar dažādām ģenētisko modifikāciju metodēm, izslēdzot ar granulām saistīto cietes sintāzes (granule-bound starch synthase, GBSS) aktivitāti. Savukārt kartupeļi ar augstu amilozes cietes saturu un/vai izmainītu amilopektīna ķēdes garumu ir radīti, izmainot divus cietes zarošanās enzīmus (starch branching enzymes, SBEs). Līdz šim zinātniekiem nebija izdevies iegūt kartupeļus ar cieti, kas satur tikai amilozi. Tiek uzskatīts, ka amilopektīna daļas klātbūtne kartupeļu cietē ir būtiski nepieciešama augu attīstībai. Tomēr zviedru zinātnieku grupai jaunākajos pētījumos, izmantojot genomiskās rediģēšanas metodi (CRISPR-Cas9 RNP), ir izdevies inducēt mutācijas Sbe1 un Sbe2 gēnos visās astoņās Sbe alelēs. Tā rezultātā viņi ir ieguvuši pilnībā nesazarotu kartupeļu
cieti.¹⁷

Pateicības
Informācija sagatavota Lauku atbalsta dienesta finansētā projekta Ar jaunām ģenētisko modifikāciju metodēm iegūtu pārtikas, dzīvnieku barības un to piedevu noteikšana un šādu produktu zinātniskā riska novērtējums ietvaros.

Izmantotā literatūra
1. Baranski, R., Klimek-Chodacka, M., & Lukasiewicz, A. (2019). Approved genetically modified (GM) horticultural plants: A 25-year perspective. Folia Horticulturae, 31(1), 3-49.
2. Battaglia, R. 2021. Modulating yield components in barley. 2nd PlantEd conference, Lecce, Italy, 20-22 September 2021.
3. Clemente TE, Cahoon EB (2009) Soybean Oil: Genetic Approaches for Modification of Functionality and Total Content. Plant Physiology 151:1030-1040
4. Dávalos, A., Henriques, R., Latasa, M. J., Laparra, M., & Coca, M. (2019). Literature review of baseline information on non‐coding RNA (ncRNA) to support the risk assessment of ncRNA‐based genetically modified plants for food and feed. EFSA Supporting Publications, 16(8), 1688E.
5. EFSA. https://open.efsa.europa.eu/study-inventory/EFSA-Q-2020-00834
6. EFSA. https://open.efsa.europa.eu/study-inventory/EFSA-Q-2019-00807
7. Ieviņš, Ģ. Augu fizioloģija. Funkcijas un mijiedarbība ar vidi. Rīga: LU Akadēmiskais apgāds, 2016. 608 lpp.
8. Lister, D. L., & Jones, M. K. (2013). Is naked barley an eastern or a western crop? The combined evidence of archaeobotany and genetics. Vegetation History and Archaeobotany, 22(5), 439-446.
9. Nonaka, S., Arai, C., Takayama, M. et al. Efficient increase of γ-aminobutyric acid (GABA) content in tomato fruits by targeted mutagenesis. Sci Rep 7, 7057 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-06400-y
10. Pavely, C. 2021. Presentation by Calyxt USA on their cereal and oilseed product pipeline. Genome Editing webinar on International Regulatory Approaches and Product Development, 8th-9th September, 2021, FAS/USDA London.
11. Takayama, M., & Ezura, H. (2015). How and why does tomato accumulate a large amount of GABA in the fruit? Frontiers in Plant Science, 6, 612.
12. Taketa S, Amano S, Tsujino Y, Sato T, Saisho D, Kakeda K, Nomura M, Suzuki T, Matsumoto T, Sato K, Kanamori H, Kawasaki S, Takeda K (2008) Barley grain with adhering hulls is controlled by an ERF family transcription factor gene regulating a lipid biosynthesis pathway. Proc Natl Acad Sci USA 105:4062-4067
13. Takeshita, T. 2021. Presentation on Sanatech Seeds’ „heart healthy” tomato – richer in gamma-aminobutyric acid (GABA), known to prevent high blood pressure. Genome Editing webinar on International Regulatory Approaches and Product Development, 8th–9th September, 2021, FAS/USDA London.
14. USDA, 2020. USDA APHIS letter of inquiry https://www.aphis.usda.gov/biotechnology/downloads/reg_loi/20-113-01_air_inquiry.pdf
15. USDA, 2020a. USDA APHIS letter of inquiry https://www.aphis.usda.gov/biotechnology/downloadsreg_loi/20-140-01_air_CBIdel_a2.pdf
16. Zariņš, Z., Neimane, L., Bodnieks, E. Uztura mācība. Rīga: LU Akadēmiskais apgāds, 2015. 422 lpp.
17. Zhao X et al (2021). Amylose starch with no detectable branching developed through DNA-free CRISPR-Cas mediated mutagenesis of two starch branching enzymes in potato. Scientific Reports, 11:1-13.